本项目是一个整合了Cut&Tag测序和RNA-seq数据的分析流程，旨在鉴定转录因子结合位点，并结合基因表达变化分析其调控功能。项目包含Cut&Tag数据的完整处理流程（从质控、比对到峰值检测和注释）、RNA-seq的差异表达分析，并最终通过Integrative_analysis模块对两者进行整合分析。
项目的建议目录结构如下：
project_root/
├── CutTag_Linux/ # 原始数据及处理脚本 (服务器端运行)
│ ├── scripts/ # 各步骤处理脚本
│ ├── raw_data/ # 原始FASTQ文件存放目录 (示例)
│ ├── genome/ # 参考基因组及注释文件
│ └── ... # 其他分析结果目录
├── CutTag_local_analysis/ # CUT&Tag下游本地分析 (本地环境运行)
│ └── *.R # R分析脚本 (如峰值注释、筛选)
├── RNA-seq_analysis/ # RNA-seq 数据分析 (本地环境运行)
│ ├── scripts/ # RNA-seq分析脚本
│ ├── results/ # RNA-seq分析结果
│ └── ...
├── Integrative_analysis/ # 整合分析 (本地环境运行)
│ ├── scripts/ # 整合分析脚本
│ └── results/ # 整合分析结果
└── reference_repos/ # 参考分析流程 (学习和参考用途)
详细的目录结构规范请参考项目级规则（如 .cursor/rules）。
本项目的分析流程主要分为服务器端分析和本地分析两部分。
服务器端分析流程主要处理原始测序数据，包括以下步骤：
- 数据准备:
scripts/config/00_config.sh: 配置全局变量、样本信息和路径。scripts/00_subsample.sh(可选): 对原始数据进行抽样，用于流程测试。
- 数据预处理:
scripts/01_fastqc.sh(可选): 使用 FastQC 对原始数据进行质量评估。scripts/01_fastqc_stats.sh: 汇总FastQC结果并生成统计报告。scripts/02_trimming.sh: 使用 Cutadapt 去除测序接头和低质量序列。scripts/02_trimming_stats.sh: 汇总去接头结果并生成统计报告。
- 序列比对:
scripts/03_alignment.sh: 使用 Bowtie2 将处理后的序列比对到参考基因组，并进行BAM文件处理（排序、标记重复、过滤）。scripts/03_alignment_stats.sh: 生成详细的比对质量报告。
- 峰值检测 (Peak Calling):
scripts/04_bedgraph_generation.sh: 生成标准化的 BedGraph 文件，作为Peak Calling的输入。scripts/04_peak_calling_macs3.sh: 使用 MACS3 进行峰值检测（推荐）。scripts/04_peak_calling_seacr.sh: (可选) 使用 SEACR 进行峰值检测。scripts/04_idr_analysis.sh: (可选) 使用 IDR (Irreproducible Discovery Rate) 分析生物学重复样本间Peak的一致性，筛选高置信度的Peak。scripts/04_peak_calling_stats.sh: 生成详细的Peak Calling统计报告。
- 下游可视化准备:
scripts/05_bam_to_bigwig.sh: 将比对产生的BAM文件转换为BigWig格式，用于在IGV等基因组浏览器中可视化。
- 高级分析 (可选):
scripts/06_generate_heatmap.sh: 使用 deepTools 生成TSS区域的信号富集热图。scripts/07_sample_correlation.sh: 使用 deepTools 分析样本间的相关性。
- IGV风格可视化:
scripts/08_plot_igv_style.sh: 使用 pyGenomeTracks 生成IGV风格的基因组浏览器图，展示特定基因区域的信号富集模式。
运行方式: 服务器端的脚本设计为通过SGE (Sun Grid Engine) 作业调度系统提交和运行。具体提交方式请参考项目级规则。
本地分析流程主要对服务器端产生的Cut&Tag峰值文件等结果，以及RNA-seq数据进行下游的注释、差异表达分析、功能富集和整合分析。
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CutTag_local_analysis: Cut&Tag峰值注释与筛选- 主要使用R包
ChIPseeker对服务器产生的peak文件进行注释，分析其在基因组上的分布特征。 05_peak_annotation_macs3.R: 对MACS3产生的peak进行注释。05_peak_annotation_idr.R: 对IDR分析产生的peak进行注释。06_filter_promoter_peaks.R: 筛选启动子区域的peak。07_filter_proximal_promoter_genes.R: 筛选近端启动子区域的峰值及其关联基因。
- 主要使用R包
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RNA-seq_analysis: 差异表达与功能富集分析scripts/01_run_DE_analysis.R: 使用edgeR等工具进行差异表达分析。scripts/02_run_enrichment_analysis.R: 对差异表达基因进行GO和KEGG等功能富集分析。- 包含多种绘图脚本 (
plot_volcano.R,plot_pca.R等) 对分析结果进行可视化。
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Integrative_analysis: 整合Cut&Tag和RNA-seq数据scripts/01_intersect_genes.R: 整合Cut&Tag的峰值数据（特别是与基因关联的峰）和RNA-seq的差异表达基因，以鉴定潜在的直接调控靶基因。scripts/02_run_enrichment_analysis.R: 对整合分析得到的基因列表进行功能富集分析。scripts/03_plot_enrichment_results.R: 对富集分析结果进行可视化。scripts/04_plot_heatmap.R: 使用ComplexHeatmap对特定的基因集（如KEGG通路基因和自定义标记基因）绘制表达热图，进行可视化分析。
运行方式: 本地分析脚本（主要是R脚本）在本地计算机环境中运行。
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Conda 环境:
cuttag -
激活方式: 在执行服务器端脚本前，使用
source activate cuttag命令激活环境。 -
主要工具: FastQC, MultiQC, Cutadapt, Bowtie2, SAMtools, Picard, MACS3, SEACR, BEDtools, deepTools, GNU Parallel。 确保这些工具已在
cuttag环境中正确安装。脚本中通常包含依赖检查步骤。 -
IGV可视化工具: 在
cuttag环境中安装pyGenomeTracks -
安装命令:
conda install -c bioconda -c conda-forge pygenometracks(在cuttag环境中执行) -
用途: 生成IGV风格的基因组浏览器图（通过
08_plot_igv_style.sh脚本）
- R 环境: R (建议版本 4.0 或更高)
- 主要R包:
tidyverse(包含ggplot2,dplyr,tidyr等),ChIPseeker,clusterProfiler,edgeR,RColorBrewer。 请确保这些R包已在本地R环境中安装。
请严格遵守项目级规则中关于文件命名和结果文件组织的规范。这有助于保持项目的一致性和可维护性。
本项目在设计和开发过程中参考了以下优秀的公开流程和教程：
- 诺唯赞流程:
reference_repos/诺唯赞流程/cuttag_cutrun分析流程v2414/(主要参考) - CebolaLab流程:
reference_repos/CebolaLab_CUTandTAG_ Analysis pipeline for CUT&TAG data.html - nf-core/cutandrun:
reference_repos/nf-core_cutandrun/ - Henikoff Lab CUT&Tag Tutorial:
reference_repos/Henikoff_CUTTag_tutorial/
- 环境分离:
CutTag_Linux目录下的脚本仅能在服务器环境运行，CutTag_local_analysis和Integrative_analysis目录下的脚本仅能在本地环境运行。 - 配置文件: 核心配置（如文件路径、样本列表）集中在
CutTag_Linux/scripts/config/00_config.sh中管理。 - SGE提交: 服务器端计算密集型任务通过SGE提交，遵循特定的脚本格式和依赖管理，详见项目级规则。
- 抽样测试: 在进行完整分析前，建议使用
00_subsample.sh对少量数据进行抽样测试，确保流程稳定。测试输出与正式分析输出严格分离。
请在各脚本文件头部根据项目级规则中的作者署名规范，明确标注作者和贡献者信息。
本文档将根据项目进展持续更新。请以实际的项目结构和脚本为准。